Jak leki biologiczne zmieniają profil cytokin w ciężkiej astmie?

Czym jest astma i jak ją klasyfikujemy?

Astma jest heterogenną, przewlekłą chorobą zapalną dróg oddechowych, charakteryzującą się nadreaktywnością, zmienną obturacją dróg oddechowych oraz objawami takimi jak świsty, duszność, kaszel i ucisk w klatce piersiowej. Obecnie astma nie jest już postrzegana jako pojedyncza jednostka chorobowa, ale jako zespół obejmujący różne fenotypy i endotypy, różniące się etiologią, manifestacją kliniczną i odpowiedzią na leczenie. Doprowadziło to do klasyfikacji astmy na dwa główne endotypy immunologiczne: zapalenie T2-high i T2-low.

Astma T2-low charakteryzuje się przewagą odpowiedzi immunologicznej zależnej od Th1 lub Th17, z towarzyszącym wydzielaniem cytokin takich jak IL-2, IL-17, IFN-γ oraz IL-1β. IL-1β produkowana przez makrofagi i komórki dendrytyczne nasila zapalenie poprzez zwiększoną rekrutację leukocytów i wspiera polaryzację Th1 w synergii z IL-12. Dodatkowo, podwyższone poziomy IFN-γ są związane z astmą T2-low oraz opornością na kortykosteroidy.

Z kolei astma T2-high jest głównie mediowana przez odpowiedzi immunologiczne typu 2, angażujące zarówno odporność wrodzoną, jak i nabytą. Główne komponenty komórkowe obejmują komórki T-pomocnicze (Th2), limfoidy wrodzone grupy 2 (ILC2), eozynofile, komórki tuczne, bazofile oraz limfocyty B produkujące immunoglobulinę E. Komórki te inicjują szereg sygnałów zapalnych poprzez uwalnianie cytokin, w tym interleukiny-4 (IL-4), IL-5, IL-9 i IL-13, które przyczyniają się do zapalenia eozynofilowego, nadmiernej sekrecji śluzu i przebudowy dróg oddechowych.

Czy leczenie biologiczne zmienia odpowiedź immunologiczną w astmie?

Leczenie biologiczne zapewnia ulgę poprzez specyficzne ukierunkowanie na komponenty układu zapalnego typu 2. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko szlakom zapalnym są dostępne w leczeniu ciężkiej astmy. Obecnie zatwierdzone przeciwciała monoklonalne w leczeniu ciężkiej astmy obejmują anty-IgE (omalizumab), anty-IL5/anty-IL5R (mepolizumab, reslizumab i benralizumab), anty-IL4R (dupilumab) oraz anty-TSLP (tezepelumab). Konkretnie benralizumab, mepolizumab i dupilumab są stosowane w leczeniu astmy eozynofilowej.

Oprócz cytokin Th1/Th2, do zapalenia związanego z astmą przyczyniają się również IL-6, CD40L, TNF-α, IFN-γ, MIP-3α i IL-10. IL-1β i TNF-α indukują IL-6, która odgrywa rolę w zapaleniu, autoimmunizacji, nowotworach i astmie. Aktywność IL-6 związana z otyłością może pogarszać funkcję płuc i zwiększać zaostrzenia astmy.

TNF-α jest kluczową cytokiną w odpowiedzi immunologicznej wrodzonej. Dysregulacja TNF-α jest związana ze stanami zapalnymi takimi jak astma, reumatoidalne zapalenie stawów i choroby zapalne jelit. Migracja eozynofilów i neutrofilów, cytotoksyczność komórek śródbłonka, aktywacja komórek T i synteza cząsteczek adhezyjnych komórek nabłonkowych są nasilane przez TNF-α. Dodatkowo, TNF-α wywołuje uwalnianie cytokin prozapalnych takich jak IL-6 i IL-8. Wstępne badania z małymi populacjami pacjentów wykazały, że leczenie anty-TNF poprawiało jakość życia związaną z astmą, nadreaktywność dróg oddechowych, funkcję płuc i częstość zaostrzeń.

CD40L (CD154) jest cząsteczką kostymulującą znajdującą się na aktywowanych komórkach T CD4+ i płytkach krwi. Oddziałuje z CD40 na komórkach B, dendrytycznych, fibroblastach i komórkach nabłonkowych/śródbłonkowych. Cząsteczki CD40 i CD40L wchodzą w interakcję, aby wywołać specyficzną odpowiedź immunologiczną i umożliwić komunikację komórkową i sygnalizację. To wiązanie promuje produkcję cząsteczek adhezyjnych, chemokin, cytokin, czynników tkankowych, reaktywnych form tlenu, różnych metaloproteinaz, czynników wzrostu i innych mediatorów zapalnych. Komórki tuczne wyrażające CD40L mogą zwiększać produkcję IgE poprzez promowanie przełączania klas w komórkach B (z udziałem IL-4, IL-13 i IL-6), co może nasilać objawy astmy.

Białko zapalne makrofagów 3-alfa (MIP-3α), znane również jako CCL20, jest kluczowe dla układu immunologicznego i procesów zapalnych. MIP-3α odgrywa istotną rolę w swojej rozległej aktywności przeciwzakaźnej. Dodatkowo, zwiększona regulacja MIP-3α jest znacząca w stanach autoimmunologicznych, takich jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów i zaburzenia zapalne jelit. Wydzielanie MIP-3α jest znacząco zwiększone przez komórki nabłonkowe po bodźcach zapalnych, w tym IL-1β i TNF-α. Ponadto, MIP-3α odgrywa rolę w patogenezie astmy, szczególnie patogenezy związanej z zapaleniem typu T2. Interleukiny IL-4 i IL-13 wpływają na zwiększenie wydzielania MIP-3α przez komórki nabłonka dróg oddechowych.

IL-10 jest potężną cytokiną modulującą, która może hamować produkcję cytokin prozapalnych (IFN-γ i TNFα) przez komórki T-pomocnicze 1 (Th1). Podobnie, IL-10 hamuje zapalenie T2 poprzez zmniejszenie uwalniania cytokin prozapalnych z komórek tucznych i zmniejszenie produkcji IgE specyficznej dla alergenu.

Jakie cele i wyniki przedstawia badanie?

Celem tego badania jest ocena zmian stężeń cytokin w ciągu 3-4 miesięcy leczenia biologicznego ciężkiej astmy eozynofilowej benralizumabem, dupilumabem i mepolizumabem. Dodatkowo, badano korelacje między stężeniami cytokin a parametrami klinicznymi, co dostarcza informacji o zmieniającym się wpływie terapeutycznym na odpowiedzi zapalne.

Badana kohorta obejmuje 39 dorosłych, głównie kobiet (76,9%), z rozpoznaniem ciężkiej astmy oskrzelowej. Pacjenci ci byli leczeni jedną z trzech terapii biologicznych – benralizumabem (n = 12), dupilumabem (n = 10) lub mepolizumabem (n = 17). Wyjściowe charakterystyki kliniczne zapewniają kompleksowy profil kohorty, zarówno ogólny, jak i stratyfikowany według grupy leczenia, oferując wgląd w ich profile demograficzne i kliniczne oraz pełne morfologie krwi.

Porównania statystyczne charakterystyk wyjściowych nie ujawniają głębokich różnic między grupami leczenia, pokazując stosunkowo jednorodną kohortę na początku terapii biologicznej. Jednak status alergiczny wykazuje znaczącą różnicę (p = 0,018), wskazując, że pacjenci leczeni dupilumabem (90,0% alergicznych) różnią się istotnie od pacjentów leczonych benralizumabem (33,3%, p < 0,05), ale nie od pacjentów leczonych mepolizumabem (47,1%, p ≥ 0,05).

Przeprowadzono analizę 18 cytokin (CD40L, GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E, IL-33, MIP-3α i TNFα) zgodnie z zestawem odczynników. Jednak w fazie po analizie, wyniki IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-17E i IL-33 były prawie niewykrywalne w obu punktach oceny. Dlatego te cytokiny nie zostały uwzględnione w badaniu.

W celu dalszego badania danych wyjściowych, w następnym kroku zbadano wzajemne oddziaływanie między wyjściowymi charakterystykami klinicznymi a systemowymi profilami cytokin zapalnych, aby wyjaśnić potencjalne zależności mechanistyczne leżące u podstaw ciężkości choroby i odpowiedzi terapeutycznej.

Macierz korelacji Spearmana ilustruje parzyste powiązania między parametrami klinicznymi a cytokinami prozapalnymi lub modulującymi (białko zapalne makrofagów-3α [MIP-3α], ligand CD40 [CD40L], interferon-gamma [IFN-γ], interleukina [IL]-10, IL-12p70, IL-15, IL-1β, IL-6 i czynnik martwicy nowotworów-alfa [TNF-α]).

Analiza ujawnia zakres powiązań zarówno pozytywnych, jak i negatywnych, głównie słabych do umiarkowanych (Rho w zakresie od -0,33 do 0,32), odzwierciedlających złożone, ale subtelne wzajemne oddziaływanie między markerami klinicznymi a zapalnymi. Zaobserwowano powiązanie między zdolnością do wchodzenia po schodach a IL-10 (Rho = -0,33, p = 0,049). Przeciwnie, FEV1% wykazuje znaczącą pozytywną korelację z IL-10 (Rho = 0,32, p = 0,047).

Dla większości cytokin nie zaobserwowano wyjściowych różnic między stężeniami cytokin w grupach pacjentów kwalifikujących się do leczenia konkretnymi lekami. Jednak poziomy CD40L różnią się znacząco (p = 0,012), pokazując, że dupilumab (mediana 2573,5 pg/mL) jest wyższy niż benralizumab (932,2 pg/mL, p < 0,05) i mepolizumab (1146,0 pg/mL, p < 0,05). Poziomy IL-6 również różnią się (p = 0,024), z dupilumabem (mediana 2,5 pg/mL) podwyższonym w porównaniu z benralizumabem (1,0 pg/mL, p < 0,05), ale nie mepolizumabem (2,3 pg/mL, p ≥ 0,05).

Analiza pokazuje zmiany w punkcie follow-up po 3-4 miesiącach terapii biologicznej, raportowane jako mediany z 95% przedziałami ufności (CI), dla stężeń cytokin, wraz z wartościami p wewnątrz grupy oceniającymi istotność zmian w czasie i wartościami p między grupami dla porównań parami (benralizumab vs. dupilumab, benralizumab vs. mepolizumab, dupilumab vs. mepolizumab). Ta analiza wyjaśnia wpływ terapeutyczny każdego leku biologicznego, podkreśla poprawę wewnątrz grup i ocenia różnice w skuteczności między terapiami.

Analiza ujawnia znaczące różnice między grupami w zmianach CD40L, z dupilumabem wykazującym wyraźną redukcję (mediana -957,0 pg/mL, 95% CI: -1868,0, -187,0, p = 0,027) w porównaniu z benralizumabem. Wartości p testu Dunna (Ben vs. Dup: 0,015, Dup vs. Mep: 0,027) potwierdzają lepszą redukcję dupilumabu. Wyjściowe poziomy CD40L są znacząco wyższe w grupie dupilumabu (mediana 2573,5 pg/mL, IQR: 1421,0-3741,5) w porównaniu z benralizumabem (mediana 932,2 pg/mL, IQR: 349,8-1650,6) i mepolizumabem (mediana 1146,0 pg/mL, IQR: 641,7-2003,0, p = 0,012).

Zaobserwowano statystycznie istotne zmniejszenie stężenia IL-10 podczas leczenia dupilumabem (mediana -5,1 ng/mL, 95% CI: -6,6, -1,0, p = 0,024) i mepolizumabem (mediana -3,0 ng/mL, 95% CI: -11,2, -0,5, p = 0,015). Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami.

IL-6 wykazuje znaczącą różnicę między grupami (Ben vs. Dup: p = 0,045), z dupilumabem osiągającym prawie istotną redukcję (mediana -0,7 pg/mL, 95% CI: -1,5, 0,0, p = 0,059). Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic dla benralizumabu i mepolizumabu. Wyjściowe poziomy IL-6 są znacząco wyższe w grupie dupilumabu (mediana 2,5 pg/mL, IQR: 1,6-3,0) w porównaniu z benralizumabem (mediana 1,0 pg/mL, IQR: 0,5-1,4, p = 0,024), z mepolizumabem pokazującym pośrednie wyniki (mediana 2,3 pg/mL, IQR: 0,8-3,4).

Zmiany TNF-α wykazują istotne różnice między grupami (Ben vs. Mep: p = 0,008, Dup vs. Mep: p = 0,045). Wyjściowe poziomy TNF-α są nieco wyższe w grupie mepolizumabu (mediana 3,4 pg/mL, IQR: 2,2-4,3) w porównaniu z benralizumabem (mediana 2,3 pg/mL, IQR: 1,0-3,1) i dupilumabem (mediana 2,4 pg/mL, IQR: 0,8-4,3), bez istotnej różnicy wyjściowej (p = 0,224).

Zaobserwowano wzrost IL-12p70 we wszystkich grupach; jednak istotność statystyczna dotyczy pacjentów jako całości (mediana 0,5 pg/mL, 95% CI: 0,0, -0,80, p = 0,032), ale nie poszczególnych grup pacjentów leczonych konkretnymi lekami. Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami.

Statystycznie istotną poprawę podczas leczenia biologicznego zaobserwowano dla następujących parametrów klinicznych: ACQ, mini-AQLQ, postrzegana duszność oceniana za pomocą zmodyfikowanej skali Borga i zdolność do wchodzenia po schodach. Wszystkie grupy osiągnęły znaczącą poprawę wewnątrz grupy (p < 0,05), ale nie było różnic między grupami.

Bieżący rozdział bada związki między zmianami wywołanymi leczeniem w parametrach klinicznych i czynnościowych płuc a profilami cytokin po 3-4 miesiącach terapii benralizumabem, dupilumabem lub mepolizumabem, z raportowaniem w formie macierzy korelacji Spearmana.

Dwie korelacje osiągają istotność statystyczną (p < 0,05), podkreślając klinicznie istotne relacje. Zdolność do wchodzenia po schodach wykazuje znaczącą negatywną korelację z IL-1β (Rho = -0,34, p = 0,045). Mini-AQLQ wykazuje znaczącą negatywną korelację z MIP-3α (Rho = -0,33, p = 0,042), wskazując, że lepsza jakość życia jest zgodna z obniżonymi poziomami MIP-3α.

To prospektywne badanie oceniało zmienne kliniczne, funkcjonalne i laboratoryjne w kohorcie pacjentów z ciężką astmą przed i podczas terapii benralizumabem, dupilumabem i mepolizumabem. Wyjściowe charakterystyki pacjentów otrzymujących leczenie biologiczne nie wykazały istotnych różnic między grupami.

Badanie prezentuje nowe spostrzeżenia dotyczące unikalnych immunomodulacyjnych cech benralizumabu, dupilumabu i mepolizumabu u osób z ciężką astmą oskrzelową, podkreślając ich różny wpływ na biomarkery zapalne. Nasze wyniki podkreślają zmienność odpowiedzi immunologicznych w astmie i wskazują, że niektóre leki biologiczne mogą selektywnie ukierunkowywać się na różne szlaki zapalne.

Najbardziej znaczące spadki CD40L i IL-6 odnotowano w kohorcie dupilumabu, co może być przypisane podwyższonym poziomom wyjściowym tych markerów. Według Tiana i wsp., zaangażowanie CD40L na komórkach nabłonkowych zwiększa ciężkość astmy, ale zmniejszenie ekspresji genu CD40 w tych komórkach prowadziło do mniejszej progresji choroby. Chociaż nie dotyczy to leczenia astmy, ale alergicznej grzybicy oskrzelowo-płucnej (ABPM), Tashiro i wsp. opisali korzystny wpływ dupilumabu na zmniejszenie poziomów CD40L.

Dupilumab wykazał skuteczność w zmniejszaniu stężeń IL-6 w płynie nosowym wśród osób z chorobą dróg oddechowych zaostrzaną przez aspirynę (AERD). Nie tylko dupilumab ma wpływ na zmniejszenie poziomów IL-6, ale mepolizumab również wywołuje ten efekt. Według Malika i wsp., leczenie mepolizumabem zmniejszyło zdolność proliferacyjną ILC2 i było związane z niższym uwalnianiem cytokin prozapalnych, takich jak IL-6. W naszym badaniu zaobserwowaliśmy spadek poziomów IL-6 tylko dla dupilumabu. Nie znaleziono istotnych zmian dla pozostałych dwóch leków.

W naszym badaniu mepolizumab spowodował najbardziej znaczącą redukcję TNF-α. Zaskakująco, ani dupilumab, ani benralizumab nie obniżyły stężeń TNF-α. Mepolizumab wykazał statystycznie istotną przewagę w tym zakresie w porównaniu z pozostałymi dwoma lekami. Z kolei w badaniu przeprowadzonym przez Rogaliani i wsp., zarówno mepolizumab, jak i benralizumab zmniejszyły poziomy TNF-α.

Interleukina (IL)-10 jest istotną cytokiną immunomodulującą, ponieważ zmniejsza produkcję prozapalnych cytokin Th2 i wspiera rozwiązanie zapalenia. Rzeczywiście, zarówno leczenie steroidami, jak i immunoterapia swoista dla alergenu są uznawane za zwiększające endogenne poziomy IL-10. Z kolei według Howella i wsp., mepolizumab miał słabszy wpływ na poziom IL-10 niż OCS. Ponadto, badania wykazały niespójne wyniki dotyczące poziomów IL-10 podczas terapii dupilumabem. Čelakovska i wsp. zaobserwowali wyraźnie podwyższone stężenie IL-10 w osoczu u pacjentów z atopowym zapaleniem skóry leczonych dupilumabem w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak Harb i wsp. wyjaśnili, że w przypadku braku sygnalizacji IL-4R, zmniejszona synteza IL-10 wynika z niewystarczającego wzrostu populacji IL-10+ TH2, a nie globalnego niedoboru w produkcji IL-10 przez komórki T CD4+. Co ciekawe, w przypadku benralizumabu, Bergantini i wsp. zaobserwowali spadek stężenia IL-10 po 1 miesiącu leczenia, podczas gdy po 6 miesiącach terapii stwierdzono wzrost poziomów IL-10. Zaskakująco, nasze badanie ujawniło, że stężenie IL-10 zmniejszyło się po 3-4 miesiącach terapii wszystkimi ocenianymi środkami biologicznymi.

IL-12p70 jest aktywną heterodimetryczną formą interleukiny 12. IL-12 jest cytokiną prozapalną i jest kluczowa zarówno dla odporności wrodzonej, jak i nabytej, ponieważ stymuluje wytwarzanie IFN-γ z komórek NK i NKT we wczesnych stadiach odpowiedzi immunologicznej i promuje rozwój komórek Th1. IL-12 stymuluje odpowiedź immunologiczną Th1 i zmniejsza odpowiedź Th2. W astmie eozynofilowej dominują odpowiedzi Th2, co skutkuje zmniejszonymi poziomami IL-12. W badaniu na zwierzętach dostarczającym IL-12 myszom wcześniej narażonym na antygen, nadreaktywność dróg oddechowych i eozynofilia płucna zostały wyeliminowane, a ekspresja IL-4 i IL-5 została zmniejszona. Wpływ leczenia biologicznego na astmę eozynofilową w odniesieniu do profilu IL12p70 pozostaje nieadekwatnie zbadany. W naszym eksperymencie zaobserwowaliśmy wzrost IL-12p70 we wszystkich grupach leczonych dupilumabem, benralizumabem i mepolizumabem. Jednak istotność statystyczna dotyczyła pacjentów jako całości, ale nie poszczególnych grup pacjentów leczonych konkretnymi lekami.

Dodatkowo, nasze badanie wykazało negatywną korelację między MIP-3α a mini-AQLQ, co oznacza, że niższe stężenie MIP-3α koreluje z lepszą jakością życia. Stężenia MIP-3α są modulowane przez cytokiny prozapalne, w tym IL-1β i TNF-α, a także cytokiny proalergiczne, takie jak IL-4 i IL-13. Co istotne, MIP-3α/CCL20 przyciąga głównie komórki Th17 i jest związany z zapaleniem neutrofilowym i ciężkimi fenotypami astmy, sugerując, że skuteczność tych trzech leków biologicznych może być częściowo wpływana przez hamowanie szlaków zapalnych związanych z Th17. Park i wsp. stwierdzili, że MIP-3α indukuje nadreaktywność dróg oddechowych i przebudowę dróg oskrzelowych, podczas gdy inhibitory MIP-3α i przeciwciała monoklonalne mogą zmniejszyć nadreaktywność dróg oddechowych, zapalenie dróg oddechowych i przebudowę dróg oddechowych spowodowaną przez MIP-3α. Z kolei nadreaktywność oskrzeli i bardziej nasilone zapalenie są związane z bardziej wyrażonymi objawami i gorszą jakością życia.

Zaobserwowaliśmy również negatywną korelację między stężeniem IL-1β a zdolnością do wchodzenia po schodach. Ta interleukina jest wysoce prozapalna i jest raportowana jako wpływająca na nasilenie zapalenia w drogach oddechowych. Według Kima i wsp., IL-1β jest związana ze zmniejszoną kontrolą astmy i FEV1. Z kolei upośledzona funkcja płuc jest związana ze zmniejszoną zdolnością do wysiłku fizycznego.

Jednak nie zaobserwowano istotnych korelacji między stężeniami cytokin a parametrami funkcji płuc. Cytokiny, zwłaszcza IL-10 i IL-12, są teraz uznawane za mające krótkie okresy półtrwania i wykazujące zmienną stabilność w krążeniu. Dlatego stężenia cytokin mogą się różnić między punktami pomiarowymi i niekoniecznie muszą być związane ze zmianami w stanie klinicznym. Ponadto, stężenia cytokin we krwi nie zawsze odzwierciedlają ich stężenia w tkankach. W przypadkach zapalenia dróg oddechowych, pomiar cytokin w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego byłby znacznie bardziej wiarygodny; ta ścieżka badań naukowych powinna być rozważona w przyszłości. Jednak ważne jest, aby zauważyć, że procedura byłaby bardziej inwazyjna.

Nasze badanie potwierdza wysoką skuteczność leków biologicznych w terapii astmy. Leczenie wszystkimi analizowanymi lekami, tj. benralizumabem, dupilumabem i mepolizumabem, skutkuje znaczną poprawą kliniczną, wyrażoną jako wzrost wyników mini-AQLQ i spadek wyników ACQ. Poprawa wyników kwestionariuszy (spadek ACQ i wzrost mini-AQLQ) podczas leczenia biologicznego jest dobrze znanym zjawiskiem opisanym w wielu badaniach naukowych, ale jest również wskaźnikiem skuteczności terapii i warunkiem kontynuowania leczenia. Ponadto, zaobserwowaliśmy znaczącą poprawę tolerancji wysiłku, zarówno pod względem postrzeganej duszności (skala Borga), jak i zdolności do wysiłku (wchodzenie po schodach). Do tej pory istnieje niewiele publikacji na temat poprawy zdolności do wysiłku fizycznego podczas biologicznego leczenia ciężkiej astmy.

Frakcja wydychanego tlenku azotu (FeNO) jest ekonomicznym, łatwym do zmierzenia biomarkerem używanym do identyfikacji zapalenia dróg oddechowych typu 2. Podwyższone poziomy FeNO są obserwowane u osób z ostrym lub przewlekłym zapaleniem dróg oddechowych, w tym astmą. FeNO może być również wykorzystywany do przewidywania odpowiedzi na wziewne kortykosteroidy, oceny przestrzegania zaleceń i określenia skuteczności leczenia biologicznego. W naszym badaniu dupilumab zmniejszył poziomy FeNO, zgodnie z jego hamowaniem IL/4/IL-13, głównego regulatora produkcji syntazy tlenku azotu w nabłonku dróg oddechowych. Jednak spadek nie jest statystycznie istotny. Mepolizumab spowodował niewielką redukcję FeNO, podczas gdy benralizumab, mimo swoich właściwości antyeozynofilowych, był związany z podwyższeniem poziomów FeNO. Ten ostatni wynik prawdopodobnie jest przypadkowy i nie ma naukowego wyjaśnienia. Według badań naukowych, benralizumab nieznacznie zmniejsza lub nie ma wpływu na wyniki FeNO.

Głównym ograniczeniem tego badania jest krótki okres obserwacji i tylko jeden punkt follow-up. Jednak ze względu na ograniczenia logistyczne i finansowe zostało ono zaprojektowane tak, aby zawierało tylko dwa punkty oceny.

Ponadto, częstość zaostrzeń podczas leczenia biologicznego nie była analizowana ze względu na krótki okres obserwacji wynoszący 3-4 miesiące.

Dalszym problemem jest ograniczona wielkość kohorty badawczej, która może tylko częściowo reprezentować wyniki znalezione w szerszej grupie pacjentów poddawanych terapii biologicznej. Również mała wielkość próby skutkuje zmniejszoną mocą statystyczną, co utrudnia identyfikację istotnych różnic, chyba że są one znaczne. Problem jest dalej komplikowany przez potencjalne nierównowagi w charakterystykach wyjściowych między grupami. Początkowo wyższe wartości parametrów w niektórych grupach mogą tworzyć iluzję zwiększonej poprawy; dlatego wnioski powinny być formułowane z ostrożnością.

Innym problemem jest brak grupy kontrolnej placebo. Nasze badanie opiera się na badaniu rzeczywistym. Jak zaobserwowano w innych badaniach tego typu z wykorzystaniem terapii biologicznej, występują również różne sytuacje. Niemniej jednak, jesteśmy świadomi, że brak grupy kontrolnej zmniejsza wiarygodność uzyskanych danych porównawczych.

Ponadto, ze względów logistycznych, 6-minutowy test chodu, wiodący test funkcjonalny do oceny wydolności wysiłkowej i wytrzymałości u pacjentów z chorobami płuc, nie został przeprowadzony. Skoncentrowaliśmy się wyłącznie na subiektywnych odczuciach, takich jak duszność, i raportach pacjentów na temat czynników, które wpływają na jakość życia pacjentów.

Jakie metody zastosowano w badaniu?

To jednoośrodkowe, prospektywne, rzeczywiste badanie przeprowadzono od kwietnia 2023 r. do września 2024 r. w Klinice Chorób Wewnętrznych, Alergologii i Immunologii Klinicznej Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego im. K. Gibińskiego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Polska. Badanie to objęło 39 pacjentów z rozpoznaniem ciężkiej astmy eozynofilowej, którzy spełnili kryteria kwalifikacyjne do leczenia w momencie włączenia; 17 z nich rozpoczęło leczenie mepolizumabem, 12 benralizumabem, a 10 dupilumabem. Reslizumab został pominięty ze względu na jego niedostępność w Polsce.

Badanie to obejmowało pacjentów, którzy spełniali kryteria rozpoczęcia leczenia biologicznego ciężkiej astmy benralizumabem, dupilumabem lub mepolizumabem zgodnie z wymogami obowiązującymi w Polsce.

Kryterium wykluczenia z tego badania było przerwanie leczenia przed punktem follow-up po 3-4 miesiącach leczenia z powodu działań niepożądanych lub życzeń pacjenta.

Siedmiopunktowy Kwestionariusz Kontroli Astmy (ACQ-7) oceniał kontrolę astmy. Pięć pytań dotyczy objawów, jedno dotyczy ratunkowych leków rozszerzających oskrzela, a jedno dotyczy FEV1. Każde zadanie jest oceniane w siedmiopunktowej skali od 0 (pełna kontrola) do 6 (największe upośledzenie). Uśrednienie pytań daje wynik ACQ. Zmiany ACQ o 0,5 są uważane za minimalnie zauważalne.

Mini-AQLQ został użyty do oceny jakości życia związanej z astmą. Mini-AQLQ składa się z 15 elementów na 7-punktowej skali, gdzie 1 oznacza znaczne upośledzenie, a 7 oznacza brak upośledzenia. Wyższy wynik kwestionariusza zwiększa jakość życia. Minimalna istotna zmiana mini-AQLQ wynosi 0,5.

Wszyscy pacjenci włączeni do tego badania przeszli rutynowe kompletne badania krwi w momencie przyjęcia na terapię biologiczną (punkt 0). Próbki pobrano przy użyciu probówki zawierającej antykoagulant (EDTA – kwas etylenodiaminotetraoctowy). Analizator hematologiczny Sysmex XN-350, wyprodukowany przez Sysmex Europe Corporation (Norderstedt, Niemcy), zmierzył i zarejestrował pełną morfologię krwi. Liczba eozynofilów w badaniu mogła być niższa niż 350/μL, ponieważ uwzględniono wynik morfologiczny w dniu przyjęcia. Wynik powyżej 350 eozynofilów w ciągu ostatnich 12 miesięcy (oznaczenie historyczne) jest również akceptowalny do rozpoczęcia leczenia biologicznego. Założyliśmy, że wszystkie oznaczenia w badaniu zostały wykonane na tym samym sprzęcie laboratoryjnym.

Dodatkowo, CRP zostało zmierzone w punkcie 0. Normę ustalono na 5 mg/L.

Dodatkowa próbka krwi do analizy panelu cytokin została pobrana po przyjęciu na terapię biologiczną (punkt 0). Próbki pełnej krwi pozostawiono do koagulacji w temperaturze otoczenia przez 30 min. Supernatant poddano wirowaniu przy 5000× g przez 10 min. Następnie próbki surowicy przechowywano w -80°C do analizy. Próbka krwi kontrolnej została pobrana po 3-4 miesiącach terapii biologicznej (punkt 1) w celu oceny zmiany stężenia wybranych cytokin (CD 40 Ligand, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E, IL-33, MIP-3α i TNFα).

Przed badaniem próbki wirowano przez 5 min. Do określenia stężeń cytokin zastosowano test multipleksowy (Human Th9/Th17/Th22 Luminex, Performance Assay18-plex Fixed Panel, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Alikvot 50 μL surowicy krwi rozcieńczono 1:2 rozcieńczalnikiem próbki, traktowano kulkami sprzężonymi z przeciwciałami, biotynylowanymi przeciwciałami wtórnymi, a następnie streptawidyną-fikoerytryną. Krzywe standardowe dla każdej analizowanej cząsteczki wygenerowano przy użyciu odpowiednich roztworów standardowych cytokin. Kulki mierzono za pomocą systemu Luminex. Wewnątrzoznaczeniowy %CV wahał się do 15%, natomiast międzyoznaczeniowy %CV różnił się do 25%, w zależności od analizowanego białka.

Alergię diagnozowano na podstawie oznaczeń alergenowo-specyficznych przeciwciał IgE w surowicy pacjentów metodą Polycheck. Stężenie > 0,35 kU/L uznano za wynik pozytywny. Drugą metodą diagnostyczną alergii były testy skórne punktowe. Pozytywny wynik testu na nadwrażliwość zależną od IgE to 3 mm bąbel pokrzywkowy z rumieniem.

Spirometrię rutynowo wykonywano u pacjentów przed podaniem leczenia biologicznego i przed zastosowaniem leku rozszerzającego oskrzela (punkt 0) oraz po 3-4 miesiącach leczenia (punkt 1). Test był wykonywany przez pielęgniarki w Oddziale Alergologii przy użyciu spirometru Spiro Scout (Ganshorn Medizin Electronic, Niederlauer, Niemcy). Oceniano następujące parametry: FEV1 (natężona objętość wydechowa), FEV1%, FVC (natężona pojemność życiowa) i FEV1/FVC.

Ponadto, podczas badania przeprowadzono test FeNO mierzący stężenie tlenku azotu w wydychanym powietrzu. Ocenę przeprowadzono za pomocą urządzenia Medisoft (Ganshorn, Niemcy) przed rozpoczęciem terapii biologicznej i podczas wizyty kontrolnej po 3-4 miesiącach leczenia.

Przeprowadzono subiektywną ocenę duszności wysiłkowej według zmodyfikowanej skali Borga (0-10 punktów), ocenianą subiektywnie według możliwości wchodzenia na określone piętro po schodach.

Ocena przeprowadzona po 3-4 miesiącach terapii była związana z koniecznością wstępnej oceny skuteczności leczenia. Zgodnie z wymogami programu lekowego w Polsce, spirometria i oceny ACQ i mini-AQLQ powinny być wykonane w tym punkcie. Ocenę następnie poszerzono o tolerancję wysiłku, FeNO i ocenę profilu cytokin. Ocenę po 3 miesiącach przeprowadzono dla dupilumabu i mepolizumabu; jednak dla benralizumabu przeprowadzono ją po 4 miesiącach ze względu na harmonogram podawania leku.

Protokół badania został zweryfikowany i zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną przy Śląskim Uniwersytecie Medycznym w Katowicach (BNW/NWN/0052/KB1/18/I/23) i był zgodny z zasadami etycznymi eksperymentów na ludziach zainicjowanymi przez Deklarację Helsińską.

Istotność statystyczną określono jako dwustronną wartość p < 0,05, z prawie istotnymi trendami odnotowanymi przy p < 0,10, odzwierciedlającymi eksploracyjny charakter badania. W oparciu o testy Shapiro-Wilka, wszystkie badania zakładały nienormalny rozkład danych, wymagający podejść nieparametrycznych.

Dla zmiennych ciągłych, mediany z przedziałami międzykwartylowymi (IQR) były raportowane dla charakterystyk wyjściowych i mediany z 95% CI dla zmian w czasie, odzwierciedlając tendencję centralną i zmienność w tej małej kohorcie. Zmienne kategoryczne zostały podsumowane jako częstości i odsetki z liczbami niebrakowymi dla danych brakujących. Aby uwzględnić skośność i małe wielkości próbek, nieparametryczne obliczenia bootstrapowe z 1000 iteracjami resamplingu generowały zakresy ufności dla zmian ciągłych.

Porównania wyjściowe między grupami leczenia (benralizumab, dupilumab, mepolizumab) zostały przeprowadzone przy użyciu testu sumy rang Kruskala-Wallisa dla zmiennych ciągłych i dokładnego testu Fishera dla zmiennych kategorycznych. Dla zmiennych ciągłych z istotnymi ogólnymi wartościami p (p < 0,05), porównania post hoc parowe zostały przeprowadzone przy użyciu testu Dunna z korektą Holma, aby kontrolować rodzinną stopę błędu w obrębie każdego parametru. Dla zmiennych kategorycznych zastosowano parowe dokładne testy Fishera z korektą współczynnika fałszywych odkryć (FDR). Wyniki analiz post hoc zostały raportowane przy użyciu systemu opartego na literach, gdzie grupy dzielące te same lub nakładające się litery wskazują brak istotnej różnicy (p ≥ 0,05 po korekcie), podczas gdy grupy z odrębnymi literami oznaczają istotne różnice (p < 0,05 po korekcie).

Dla danych sparowanych, zmiany parametrów klinicznych od wartości wyjściowej do 3-4-miesięcznego follow-up zostały obliczone jako różnica (post leczenie minus wartość wyjściowa) dla sparowanych obserwacji. Wewnątrzgrupowa istotność tych zmian została oceniona przy użyciu testu rang ze znakiem Wilcoxona. Różnice między grupami w zmianach zostały przeanalizowane przy użyciu testu Kruskala-Wallisa, a następnie testu Dunna dla porównań parowych (benralizumab vs. dupilumab, benralizumab vs. mepolizumab, dupilumab vs. mepolizumab).

Analizy korelacji zostały przeprowadzone przy użyciu metody Spearmana w celu oceny nieparametrycznych powiązań między zmiennymi. Wartości p zostały oszacowane przy użyciu asymptotycznego przybliżenia statystyki t. Biorąc pod uwagę ograniczoną wielkość próby, rozległy zakres parametrów w analizie korelacji i eksploracyjny cel generowania hipotez, a nie ustalania konkluzywnych efektów, nie zastosowano korekt dla wielu porównań.

Analizy zostały przeprowadzone przy użyciu języka statystycznego R (wersja 4.3.3; R Core Team, 2024) na systemie Windows 11 Pro 64 bit (build 26,100), wykorzystując pakiety boot (wersja 1.3.29).

Jakie efekty kliniczne ujawnia terapia biologiczna?

Benralizumab, dupilumab i mepolizumab są wysoce skutecznymi środkami biologicznymi w leczeniu ciężkiej astmy. Promują one redukcję cytokin prozapalnych, szczególnie obserwowaną podczas terapii dupilumabem. Niemniej jednak, ze względu na małą wielkość próby i niestabilne stężenia cytokin w surowicy krwi, wyniki powinny być interpretowane z ostrożnością.

Ponadto, stwierdzono znaczną poprawę kliniczną charakteryzującą się spadkiem wyników ACQ, wzrostem wyników mini-AQLQ i zwiększoną tolerancją wysiłku. Ponadto, dupilumab wykazał najbardziej zauważalną redukcję FeNO wśród ocenianych leków; jednak nie był to wynik statystycznie istotny.

Podsumowanie

Badanie prospektywne przeprowadzone w Klinice Chorób Wewnętrznych, Alergologii i Immunologii Klinicznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego objęło 39 pacjentów z ciężką astmą eozynofilową leczonych benralizumabem, dupilumabem lub mepolizumabem. Głównym celem była ocena zmian stężeń cytokin prozapalnych po 3-4 miesiącach terapii biologicznej oraz analiza korelacji między biomarkerami zapalnymi a parametrami klinicznymi. Astma, jako heterogenna choroba zapalna dróg oddechowych, została podzielona na endotypy T2-high i T2-low, z czego terapie biologiczne celują głównie w szlaki zapalne typu 2, obejmujące cytokiny takie jak IL-4, IL-5, IL-13 oraz mechanizmy związane z eozynofilami i IgE.

Wyniki badania wykazały, że dupilumab spowodował najbardziej znaczące redukcje stężeń CD40L i IL-6, co może wynikać z ich podwyższonych poziomów wyjściowych w tej grupie pacjentów. Mepolizumab natomiast wykazał najsilniejszy wpływ na obniżenie TNF-α, istotnej cytokiny prozapalnej związanej z migracją eozynofilów i neutrofilów. Wszystkie trzy leki biologiczne przyczyniły się do zmniejszenia stężenia IL-10, cytokiny immunomodulującej, co stanowi zaskakujące odkrycie wymagające dalszych badań. Zaobserwowano także wzrost IL-12p70 we wszystkich grupach, co może wskazywać na przesunięcie równowagi immunologicznej w kierunku odpowiedzi Th1. Analiza korelacji ujawniła negatywny związek między MIP-3α a jakością życia oraz między IL-1β a zdolnością do wysiłku fizycznego, sugerując, że redukcja tych cytokin może przekładać się na poprawę funkcjonowania pacjentów.

Wszystkie badane terapie biologiczne przyniosły istotną poprawę kliniczną, wyrażoną spadkiem wyników ACQ, wzrostem mini-AQLQ oraz zwiększoną tolerancją wysiłku fizycznego ocenianą zarówno subiektywnie według skali Borga, jak i obiektywnie poprzez test wchodzenia po schodach. Dupilumab wykazał tendencję do obniżania FeNO, biomarkera zapalenia dróg oddechowych typu 2, co jest zgodne z jego mechanizmem hamowania IL-4 i IL-13. Badanie potwierdza, że różne leki biologiczne wywierają odmienne efekty immunomodulacyjne, selektywnie wpływając na poszczególne szlaki zapalne, co podkreśla heterogenność astmy i konieczość personalizacji terapii. Ograniczenia badania obejmują krótki okres obserwacji, brak grupy kontrolnej placebo oraz małą liczebność kohorty, co wymaga ostrożności w interpretacji wyników i wskazuje na potrzebę dalszych, długoterminowych badań z większymi grupami pacjentów.